نوقشت في قسم علوم الحياة أطروحة دكتوراه وهي جزء من متطلبات نيل درجة دكتوراه فلسفة في علوم الحياة / علم الاحياء المجهرية للطالب احمد جمال حسين السرحان عنوان الاطروحة (استخدام دقائق الفضة النانوية المنتجة من بكترياPseudomonas aeruginosaكنظام لتسليم الممنع) . وبأشراف الاتاذ الدكتورة فريال جميل عبد عطية .
في هذه الدراسة تم جمع 155 عينة شملت العينات السريرية والعينات البيئية من المستشفى . العينات السريرية 58 عزلت من المرضى الذين يعانون من إصابات الحروق و والتهاب المجاري البولية وتجرثم الدم . وجمعت العينات البيئية من الأسرة والمطهرات وغرف المرضى في مستشفى الحلة التعليمي من اذار2016 الى ايار 2016 . شخصت العزلات بالاعتماد على الاختبارات المزرعية و الكيموحيوية فضلا عن تشخيصها بوساطة جهاز VITEK 2 . و من مجموع 155 عينة كانت 30 عزلة تعود لبكتريا Pseudomonas aeruginosa بنسبة 19.35% .
تم التخليق الخضري لدقائق الفضة النانوية (AgNPs) باستخدام عالق بكترياP.aeruginosa. كما تمت دراسة صفات دقائق الفضة النانوية باستخدامالأشعة فوق البنفسجية -المرئية الطيفي و حيود الأشعة السينية (XRD) وتشتت طاقة الاشعة السينية (EDX) و الأشعة تحت الحمراء الطيفي ( FTIR) والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) .
اظهر الفحص الجزيئي عن السموم الخارجية للبكتريا بوساطة جهاز تفاعل البلمرة المتسلسل وباستعمال بادئات متخصصة للجينات ( EXO A , EXO T and EXO S) وكانت جميع العازلات موجبة للسم الخارجيA و السم الخارجيTبينما أعطت 22 عزلة نتيجة موجبة للسم الخارجي S. هذه النتائج اشارت إلى أن وجود جينات السموم الخارجية هي عوامل ضراوة بارزة لعزلاتP.aeruginosa.
وقد تم إنتاج السم الخارجي A من بكتريا Pseudomonas aeruginosa في وسط مرق الصويا المديلز وتنقيته باستخدام نسبة اشباع85? من كبريتات الأمونيوم ثم بواسطة عمود كروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لإنتاج سم عالي النقاوة بعد ذلك تم تحديد الوزن الجزيئي للسم المنقى ليكون 71كيلو دالتون .
اما الدراسة المناعية تضمنت دراسة الخصائص المستضدية للتوكسويد و دقائق الفضة النانوية و المستضد المختلط المكون من التوكسويد ودقائق الفضة النانوية ثم التحري عن الدورالمناعي لدقائق الفضة النانوية كنظام اعطاء .اذ تمت باستخدام20 ارنب قسمت الى اربعة مجاميع كل مجموعة تضمنت5 ارانب ,حيث حقنت المجموعة الاولى بالتوكسويد فقط اما المجموعة الثانية فقد حقنت بدقائق الفضة النانوية فقط والمجموعة الثالثة فقد حقنت بالمستضد المختلط ,اما المجموعة الرابعة فحقنت بالمحلول الملحي الفسلجي واعتبرت كسيطرة, وبعد انتهاء مده التمنيع تم التحري عن بعض المعايير المناعية .
واظهرت نتائج كل الفحوصات المناعية المستخدمة في هذه الدراسة ان كل من التوكسويد و دقائق الفضة النانوية و المستضد المختلط قد اعطت زيادة معنوية بالمقارنة مع مجموعة السيطرة وعلى مستوى احتمالية P<0.05 .فقد اظهرت نتائج اختبار اختزال الصبغة ( NBT ) التي تم الحصول عليها لهذه المستضدات الثلاثة في هذا الاختبار بمعدل(66.8%, 60.6%و 73.6% ) على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(46.8%) . و تم استخدام اختبار الجلد حيث اظهرت النتائج ان هذه المستضدات الثلاثة أثرت في تفاعل الحساسية sensitivity للأرانب وقد ادت المستضدات المحقونة الى زيادة معنويه في قطر الانتفاخ بعد 4,24,48,72 ساعة مقارنة مع مجموعه السيطرة على مستوى احتمالية P<0.05.وتم استخدام اختبار معامل الانقسام ايضا والنتائج التي تم الحصول عليها بمعدل(26.96%, 22.8%, 32.11%) على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(13.33%). بالإضافة الى ذلك فقد تم استخدام طريقة الانتشار المناعي لتقدير مستوى الانتشار المناعي للكلوبيولينات المناعية في المصل, فقد اظهرت النتائج بان مستوى الكلوبيولينات المناعية بمعدل (17, 19.8 و 19.4 ( ملم على التوالي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة عند P <0.05. وايضا تم استخدام تقنية الامتزاز المناعي المرتبط بالأنزيم (ELISA) لتقدير تركيز عناقيد التمايز في المصل CD4 وCD8, وقد كان تركيزCD4 بمعدل (47.49 , 43.82 و 63.61 )نانوغرام\مل على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(26.59)نانوغرام\مل في حين تركيزCD8 بمعدل (2.79, 3.21و 6.08)نانوغرام\مل بينما مجموعة السيطرة بمعدل (1.6)نانوغرام\مل .
و قد اظهرت الدراسة النسيجية بان ليس هنالك افات مرضية في مجاميع الارانب الممنعة بأنواع مختلفة من المستضدات . حيث اظهر الكبد ارتشاح للخلايا الالتهابية في المنطقة البوابية و التهاب نقطي في الفصيصات الكبدية في مجموعة التوكسويد و مجموعة المستضد المختلط بينما اظهرت مجموعة دقائق الفضة النانوية ارتشاح للخلايا الالتهابية في المنطقة البوابية فقط . كما اظهر الطحال فرط تنسج للمفاويات في منطقة اللب الابيض لمجاميع الارانب الممنعة .
في هذه الدراسة تم جمع 155 عينة شملت العينات السريرية والعينات البيئية من المستشفى . العينات السريرية 58 عزلت من المرضى الذين يعانون من إصابات الحروق و والتهاب المجاري البولية وتجرثم الدم . وجمعت العينات البيئية من الأسرة والمطهرات وغرف المرضى في مستشفى الحلة التعليمي من اذار2016 الى ايار 2016 . شخصت العزلات بالاعتماد على الاختبارات المزرعية و الكيموحيوية فضلا عن تشخيصها بوساطة جهاز VITEK 2 . و من مجموع 155 عينة كانت 30 عزلة تعود لبكتريا Pseudomonas aeruginosa بنسبة 19.35% .
تم التخليق الخضري لدقائق الفضة النانوية (AgNPs) باستخدام عالق بكترياP.aeruginosa. كما تمت دراسة صفات دقائق الفضة النانوية باستخدامالأشعة فوق البنفسجية -المرئية الطيفي و حيود الأشعة السينية (XRD) وتشتت طاقة الاشعة السينية (EDX) و الأشعة تحت الحمراء الطيفي ( FTIR) والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) .
اظهر الفحص الجزيئي عن السموم الخارجية للبكتريا بوساطة جهاز تفاعل البلمرة المتسلسل وباستعمال بادئات متخصصة للجينات ( EXO A , EXO T and EXO S) وكانت جميع العازلات موجبة للسم الخارجيA و السم الخارجيTبينما أعطت 22 عزلة نتيجة موجبة للسم الخارجي S. هذه النتائج اشارت إلى أن وجود جينات السموم الخارجية هي عوامل ضراوة بارزة لعزلاتP.aeruginosa.
وقد تم إنتاج السم الخارجي A من بكتريا Pseudomonas aeruginosa في وسط مرق الصويا المديلز وتنقيته باستخدام نسبة اشباع85? من كبريتات الأمونيوم ثم بواسطة عمود كروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لإنتاج سم عالي النقاوة بعد ذلك تم تحديد الوزن الجزيئي للسم المنقى ليكون 71كيلو دالتون .
اما الدراسة المناعية تضمنت دراسة الخصائص المستضدية للتوكسويد و دقائق الفضة النانوية و المستضد المختلط المكون من التوكسويد ودقائق الفضة النانوية ثم التحري عن الدورالمناعي لدقائق الفضة النانوية كنظام اعطاء .اذ تمت باستخدام20 ارنب قسمت الى اربعة مجاميع كل مجموعة تضمنت5 ارانب ,حيث حقنت المجموعة الاولى بالتوكسويد فقط اما المجموعة الثانية فقد حقنت بدقائق الفضة النانوية فقط والمجموعة الثالثة فقد حقنت بالمستضد المختلط ,اما المجموعة الرابعة فحقنت بالمحلول الملحي الفسلجي واعتبرت كسيطرة, وبعد انتهاء مده التمنيع تم التحري عن بعض المعايير المناعية .
واظهرت نتائج كل الفحوصات المناعية المستخدمة في هذه الدراسة ان كل من التوكسويد و دقائق الفضة النانوية و المستضد المختلط قد اعطت زيادة معنوية بالمقارنة مع مجموعة السيطرة وعلى مستوى احتمالية P<0.05 .فقد اظهرت نتائج اختبار اختزال الصبغة ( NBT ) التي تم الحصول عليها لهذه المستضدات الثلاثة في هذا الاختبار بمعدل(66.8%, 60.6%و 73.6% ) على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(46.8%) . و تم استخدام اختبار الجلد حيث اظهرت النتائج ان هذه المستضدات الثلاثة أثرت في تفاعل الحساسية sensitivity للأرانب وقد ادت المستضدات المحقونة الى زيادة معنويه في قطر الانتفاخ بعد 4,24,48,72 ساعة مقارنة مع مجموعه السيطرة على مستوى احتمالية P<0.05.وتم استخدام اختبار معامل الانقسام ايضا والنتائج التي تم الحصول عليها بمعدل(26.96%, 22.8%, 32.11%) على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(13.33%). بالإضافة الى ذلك فقد تم استخدام طريقة الانتشار المناعي لتقدير مستوى الانتشار المناعي للكلوبيولينات المناعية في المصل, فقد اظهرت النتائج بان مستوى الكلوبيولينات المناعية بمعدل (17, 19.8 و 19.4 ( ملم على التوالي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة عند P <0.05. وايضا تم استخدام تقنية الامتزاز المناعي المرتبط بالأنزيم (ELISA) لتقدير تركيز عناقيد التمايز في المصل CD4 وCD8, وقد كان تركيزCD4 بمعدل (47.49 , 43.82 و 63.61 )نانوغرام\مل على التوالي بينما مجموعة السيطرة بمعدل(26.59)نانوغرام\مل في حين تركيزCD8 بمعدل (2.79, 3.21و 6.08)نانوغرام\مل بينما مجموعة السيطرة بمعدل (1.6)نانوغرام\مل .
و قد اظهرت الدراسة النسيجية بان ليس هنالك افات مرضية في مجاميع الارانب الممنعة بأنواع مختلفة من المستضدات . حيث اظهر الكبد ارتشاح للخلايا الالتهابية في المنطقة البوابية و التهاب نقطي في الفصيصات الكبدية في مجموعة التوكسويد و مجموعة المستضد المختلط بينما اظهرت مجموعة دقائق الفضة النانوية ارتشاح للخلايا الالتهابية في المنطقة البوابية فقط . كما اظهر الطحال فرط تنسج للمفاويات في منطقة اللب الابيض لمجاميع الارانب الممنعة .
